2024年8月10日 上海交通大學(xué)章雪晴團(tuán)隊(duì)與新澤西理工學(xué)院許曉陽團(tuán)隊(duì)在期刊《Nature Communications》上發(fā)表題為" Optimized inhaled LNP formulation for enhanced treatment of idiopathic pulmonary fibrosis via mRNA-mediated antibody therapy "的研究論文。
研究團(tuán)隊(duì)初步設(shè)計(jì)了7種不同脂質(zhì)摩爾比的LNP制劑，經(jīng)艾特森MPE-L2型微流控制備儀制備樣品后，為后續(xù)制劑篩選與理化性質(zhì)評(píng)估提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
研究背景
特發(fā)性肺纖維化(IPF)是高死亡率的間質(zhì)性肺病，現(xiàn)有藥物僅能延緩病程，無法逆轉(zhuǎn)瘢痕；基于 mRNA 的蛋白替代療法雖具潛力，但mRNA穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低，需依賴有效遞送系統(tǒng)。
脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)在相關(guān)藥物和疫苗中展現(xiàn)價(jià)值，卻存在肺部靶向性不足的問題，而吸入給藥雖為呼吸系統(tǒng)疾病的理想途徑，卻面臨霧化剪切力損傷等多重挑戰(zhàn)，目前尚無吸入性LNP-mRNA候選藥物完成臨床試驗(yàn)，因此亟需開發(fā)具備轉(zhuǎn)化潛力的吸入性LNP遞送系統(tǒng)及便捷篩選方法，因此，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了新的LOOP平臺(tái)遞送mRNA。
1. 制備過程
圖例1：LNP制備過程
2. 篩選過程
圖例2：LNP篩選過程
3. scFv@iLNP-HP08LOOP治療IPF的吸入遞送機(jī)制
研究團(tuán)隊(duì)初步明確了”scFv@iLNP-HP08LOOP”的核心作用路徑，該遞送系統(tǒng)經(jīng)吸入后可抵抗霧化剪切力，進(jìn)入肺間質(zhì)并被多種細(xì)胞內(nèi)化，隨后通過溶酶體逃逸釋放IL-11 scFv mRNA，在核糖體的作用下翻譯為IL-11 scFv，最終通過自分泌或旁分泌方式結(jié)合IL-11，阻斷下游纖維化信號(hào)通路。
圖例3：scFv@iLNP-HP08LOOP治療IPF的吸入遞送機(jī)制圖
4. 霧化mRNA遞送用iLNP的“LOOP”篩選流程與結(jié)果
研究團(tuán)隊(duì)初步設(shè)計(jì)的7種不同脂質(zhì)摩爾比的LNP制劑，經(jīng)過艾特森MPE-L2微流控制備儀制備樣品后，通過評(píng)估霧化前后的包封效率、粒徑及PDI的變化，篩選出LNP-3作為候選制劑；隨后探究不同透析緩沖液的影響，發(fā)現(xiàn)pH 6.0的HEPEs可使LNP霧化后理化性質(zhì)變化最小，確定為較好透析條件。這一篩選流程明確了iLNP 優(yōu)化的核心指標(biāo)與關(guān)鍵緩沖液參數(shù)，為后續(xù)引入輔料改善霧化穩(wěn)定性提供了基礎(chǔ)。
圖例4：霧化mRNA遞送用iLNP的“LOOP”篩選流程與結(jié)果
5.輔料對霧化iLNP性能的改善作用
進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)在霧化緩沖液中引入乙醇、丙二醇、泊洛沙姆188三種輔料，發(fā)現(xiàn)其可通過降低表面張力、增加溶液粘度提升LNP霧化穩(wěn)定性，且輔料濃度與肺部熒光素酶表達(dá)呈正相關(guān)；隨后對比安全性與表達(dá)效率，確定8mg/mL泊洛沙姆188為最終霧化緩沖液，該緩沖液還可增強(qiáng)市售ALC0315 LNPs的穩(wěn)定性。
圖例5：輔料對霧化iLNP性能的改善作用
6. iLNP-HP08LOOP的理化性質(zhì)與生物特性表征
研究團(tuán)隊(duì)為明確脂質(zhì)組成與活性的關(guān)系，通過制備mEGFP@iLNP-HP08 LOOP，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性良好，能有效保護(hù)mRNA不被降解，且轉(zhuǎn)染效率呈劑量依賴性；隨后通過抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)其主要經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)具備快速溶酶體逃逸能力，且無明顯細(xì)胞毒性，霧化前后結(jié)構(gòu)與包封效率保持穩(wěn)定。這些表征結(jié)果驗(yàn)證了 iLNP-HP08LOOP 平臺(tái)具有優(yōu)秀的遞送潛力。
圖例6：iLNP-HP08LOOP的理化性質(zhì)與生物特性表征
7. scFv@iLNP-HP08LOOP對MLFs分化、遷移及侵襲的抑制作用
接著，研究團(tuán)隊(duì)將編碼IL-11 scFv 片段的mRNA封裝于iLNP中，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染MLFs后，IL-11 scFv呈劑量依賴性持續(xù)表達(dá)并有效結(jié)合IL-11；隨后通過免疫熒光與Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該制劑能顯著抑制TGF-β1/IL-11誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化、ECM沉積及遷移侵襲能力，且可下調(diào)下游p-ERK 信號(hào)通路。
圖例7：ASFV-ΔE120R體內(nèi)安全性及無病毒殘留驗(yàn)證
8. scFv@iLNP-HP08LOOP抑制小鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
通過建立小鼠肺纖維化模型，設(shè)置多種給藥對照組，經(jīng)形態(tài)觀察、器官系數(shù)計(jì)算、免疫熒光染色等檢測結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，吸入scFv@iLNP-HP08LOOP能顯著減輕肺組織損傷與僵硬程度，降低羥脯氨酸含量及纖維化標(biāo)志物表達(dá)；隨后對比不同給藥方式，證實(shí)其療效優(yōu)于靜脈注射和直接吸入IL-11 scFv，且在支氣管肺泡灌洗液中能維持更長時(shí)間的高表達(dá)。
圖例8：scFv@iLNP-HP08LOOP抑制小鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化
9. 肺組織組織學(xué)評(píng)估與IL-11下游信號(hào)通路分析
研究團(tuán)隊(duì)對小鼠肺組織進(jìn)行多組學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)scFv@iLNP-HP08LOOP可顯著改善肺泡隔增厚，減少膠原纖維產(chǎn)生，對肺組織結(jié)構(gòu)修復(fù)效果突出；隨后通過Western blot檢測證實(shí)，其抗纖維化作用主要通過抑制IL-11下游p-ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，而STAT3通路不受影響。這一機(jī)制解析明確了制劑的作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供了理論支撐。
圖例9：肺組織組織學(xué)評(píng)估與IL-11下游信號(hào)通路分析
10. scFv@iLNP-HP08LOOP 恢復(fù)纖維化小鼠的肺功能
研究團(tuán)隊(duì)采用強(qiáng)迫振蕩技術(shù)檢測肺功能參數(shù)，發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)的纖維化小鼠呼吸阻力、彈性顯著升高，吸氣容量、肺活量等指標(biāo)顯著降低；隨后證實(shí)吸入scFv@iLNP-HP08LOOP能有效逆轉(zhuǎn)這些異常指標(biāo)，使肺部內(nèi)在彈性恢復(fù)接近健康水平。肺功能的顯著改善凸顯了該制劑的臨床潛力。
圖例10：吸入scFv@iLNP-HP08LOOP恢復(fù)纖維化小鼠的肺功能
知識(shí)分享：研究亮點(diǎn)
1 創(chuàng)新提出“LOOP”四步篩選平臺(tái)，無需大量篩選即可獲得抗剪切力強(qiáng)、表達(dá)效率高的吸入性脂質(zhì)納米顆粒(iLNP)，還可增強(qiáng)市售ALC0315 LNPs的穩(wěn)定性。
2 構(gòu)建iLNP-HP08LOOP制劑，通過高輔助脂質(zhì)比例、酸性透析緩沖液及含泊洛沙姆188的霧化緩沖液，實(shí)現(xiàn)mRNA的高效遞送與穩(wěn)定表達(dá)。
3 開發(fā)mRNA介導(dǎo)的IL-11 scFv吸入療法，相較于傳統(tǒng)抗體給藥方式，更高效抑制肺纖維化，且顯著改善模型小鼠肺功能，為呼吸系統(tǒng)疾病治療提供新路徑。
參考文獻(xiàn)：
Nature Communications (IF 15.7) Pub Date: 2024-08-10 , DOI: 10.1038/s41467-024-51056-8.
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