2025年9月20日 ，長春獸醫(yī)研究所扈榮良團(tuán)隊(duì)在《Emerging Microbes & Infections》上發(fā)表了題為" Deletion of the African swine fever virus E120R gene completely attenuates its virulence by enhancing host innate immunity and impairing virus release "的學(xué)術(shù)論文。
本次研究通過同源重組技術(shù)，用含p72啟動子和mCherry的報告基因盒替換ASFV SY18的E120R基因，轉(zhuǎn)染骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs)后，結(jié)合熒光篩選與有限稀釋法分離重組病毒ASFV-ΔE120R，再經(jīng)艾特森LDS-L2型超濾設(shè)備去除宿主細(xì)胞碎片純化病毒。
研究背景
非洲豬瘟病毒(ASFV)致家豬致命性出血病，威脅全球養(yǎng)豬業(yè)，目前無有效商用疫苗或藥物?，F(xiàn)有減毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)、病毒排毒風(fēng)險，影響臨床應(yīng)用。鑒于E120R基因功能未明確且此前構(gòu)建其缺失株未果，本研究以高致病性Ⅱ型SY18株為基礎(chǔ)，構(gòu)建E120R基因缺失重組病毒ASFV-ΔE120R，探究E120R基因功能，評估該缺失株的減毒特性、安全性、免疫原性及對親本病毒的保護(hù)效力，為非洲豬瘟疫苗研發(fā)提供新靶標(biāo)與候選株。
1. 實(shí)驗(yàn)過程
圖例1：siGSDMD-LNPs的制備流程及膿毒癥緩解機(jī)制示意圖
2. ASFV-ΔE120R的構(gòu)建驗(yàn)證與體外復(fù)制能力分析
研究團(tuán)隊(duì)通過PCR、測序和Western blot證實(shí)E120R基因被成功敲除；生長曲線顯示該缺失株在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力顯著低于野生株。
圖例2：ASFV-ΔE120R的構(gòu)建驗(yàn)證與體外復(fù)制能力分析
3. ASFV-ΔE120R感染細(xì)胞的異常形態(tài)觀察
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)：缺失株感染細(xì)胞24小時出現(xiàn)異常管狀結(jié)構(gòu)，48小時陽性細(xì)胞占比達(dá)84%，而野生株無此結(jié)構(gòu)，說明E120R的缺失會破壞病毒粒子的正常形態(tài)。
圖例3：ASFV-ΔE120R感染細(xì)胞的異常形態(tài)觀察
4. E120R缺失對病毒粒子釋放能力的影響
研究團(tuán)隊(duì)在電鏡結(jié)果上未觀察到缺失株的出芽過程，但病毒滴度檢測結(jié)果顯示，24-48小時內(nèi)缺失株上清液病毒滴度比野生株低1-2個log??TCID??/mL，證實(shí)其病毒釋放能力受損。
圖例4：E120R缺失對病毒粒子釋放能力的影響
5.ASFV-ΔE120R對康復(fù)豬血清的敏感性檢測
熒光顯微鏡、病毒滴度及基因組拷貝檢測結(jié)果顯示，康復(fù)豬血清可顯著抑制缺失株的復(fù)制，而對野生株和ASFV-ΔI267L無明顯作用，說明缺失株的抗原表位暴露狀態(tài)發(fā)生改變，更容易被康復(fù)豬血清中的抗體識別并中和。
圖例5：ASFV-ΔE120R對康復(fù)豬血清的敏感性檢測
6. ASFV-ΔE120R激活宿主抗病毒免疫的分子機(jī)制
RNA測序熱圖顯示，缺失株感染后趨化因子、干擾素刺激基因等抗病毒基因表達(dá)顯著上調(diào)；GO和KEGG富集分析表明差異基因富集于固有免疫和炎癥信號通路上。
圖例6：ASFV-ΔE120R激活宿主抗病毒免疫的分子機(jī)制
7. ASFV-ΔE120R體內(nèi)安全性及無病毒殘留驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步驗(yàn)ASFV-ΔE120R體內(nèi)安全性，研究發(fā)現(xiàn)免疫仔豬的組織病理切片無非洲豬瘟典型病變；qPCR和細(xì)胞培養(yǎng)未檢測到組織中的病毒核酸和活性病毒，證明該毒株在體內(nèi)無法復(fù)制和殘留。
圖例7：ASFV-ΔE120R體內(nèi)安全性及無病毒殘留驗(yàn)證
8. ASFV-ΔE120R的體內(nèi)安全性與免疫原性評估
隨后，研究團(tuán)隊(duì)對免疫仔豬體內(nèi)免疫原性進(jìn)行評估，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：28天觀察期內(nèi)體溫正常、無臨床癥狀、無病毒排毒；ELISA實(shí)驗(yàn)顯示加強(qiáng)免疫后所有仔豬產(chǎn)生p54特異性抗體；ELISpot證實(shí)其可誘導(dǎo)IFN-γ分泌型PBMC應(yīng)答。
圖例8：ASFV-ΔE120R的體內(nèi)安全性與免疫原性評估
9. ASFV-ΔE120R對親本毒株攻毒的保護(hù)效果分析
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，對5頭免疫豬進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，其中2頭存活，存活豬無明顯臨床癥狀、組織無病毒核酸，抗體水平和 IFN-γ 分泌細(xì)胞數(shù)量顯著升高，CD8?IFN-γ? T 細(xì)胞比例上調(diào)。
圖例9：ASFV-ΔE120R對親本毒株攻毒的保護(hù)效果分析
10. ASFV-ΔE120R 免疫減輕攻毒后組織病理損傷
野生株對照組出現(xiàn)嚴(yán)重器官出血、壞死；存活免疫豬僅扁桃體輕微淋巴細(xì)胞壞死，其他器官無病理異常，組織病理評分顯著低于對照組。
圖例10：ASFV-ΔE120R免疫減輕攻毒后組織病理損傷
知識分享：研究亮點(diǎn)
1 本研究以高致病性Ⅱ型非洲豬瘟病毒SY18株為基礎(chǔ)，首次成功構(gòu)建E120R基因缺失重組病毒ASFV-ΔE120R，突破此前E120R基因被認(rèn)為可能對病毒復(fù)制至關(guān)重要的研究認(rèn)知，明確其非必需性及作為疫苗靶標(biāo)的潛力。
2 采研究發(fā)現(xiàn)ASFV-ΔE120R通過形成異常管狀結(jié)構(gòu)、顯著降低病毒粒子釋放能力實(shí)現(xiàn)完全減毒，且能更強(qiáng)激活宿主固有免疫(如上調(diào)趨化因子、干擾素刺激基因表達(dá))，同時在免疫豬體內(nèi)無病毒排毒，解決傳統(tǒng)減毒疫苗排毒及毒力返強(qiáng)的關(guān)鍵問題。
3 動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ASFV-ΔE120R安全性良好，可誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，對親本病毒SY18攻毒提供40%保護(hù)率，為非洲豬瘟安全高效減毒活疫苗研發(fā)提供新靶標(biāo)與候選株。
參考文獻(xiàn)：
Emerging Microbes & Infections ( IF 5.5 ) Pub Date : 2025-09-20, DOI: 10.1080/22221751.2025.2555722.
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