2025年2月12日 ，大連理工大學生物工程學院林佳奇團隊，在《Molecular Therapy - Nucleic Acids》上發(fā)表題為" Enhancing mRNA translation efficiency by introducing sequence optimized AU-rich elements in 3′UTR via HuR anchorage "的研究論文。
本次實驗中，幾種脂質納米顆粒(LNP)的制備全程采用艾特森微流控制備儀MPE-L2完成。該設備具備流量可控、混合效率高等特點，能夠實現(xiàn)LNP的標準化、規(guī)?；苽洌行ПＷC了不同組別LNP產物的均一性與穩(wěn)定性，為后續(xù)實驗的準確性提供了設備支撐。
研究背景
mRNA技術在疫苗研發(fā)、免疫治療等多個生物醫(yī)學領域應用前景廣闊，其憑借精準表達目標蛋白、研發(fā)周期短、安全性較高等優(yōu)勢，成為近年來的研究熱點。然而，mRNA自身存在胞內穩(wěn)定性低、目標蛋白表達持續(xù)時間短暫等關鍵技術瓶頸，嚴重制約了該技術的產業(yè)化落地與臨床應用推進。針對這一問題，本次研究重點聚焦3'非翻譯區(qū)(3'UTR)序列優(yōu)化，提出通過插入富腺苷酸/尿苷酸元件(AU-rich elements, ARE)結合RNA結合蛋白HuR，提升mRNA穩(wěn)定性與翻譯效率的新策略。
1. 實驗過程
? LNP制備過程：
圖例1：LNP制備過程
? 制備LNPs工藝條件：
基于上述研究策略與艾特森微流控設備，本次實驗成功制備出三種LNPs：
a)Non-ARE：不含AU rich元件；
b)ARE-F：將AU rich元件插在3’UTR前端；
c)ARE-T60：重復序列長度為60bp。
2. ARE插入3'UTR的位置篩選
研究團隊設計含不同3'UTR ARE插入位點(起始ARE-F、中間ARE-M、末端ARE-R)的熒光素酶mRNA，以無ARE的Non-ARE為對照。體外轉染5種細胞系后，ARE-F組的熒光素酶表達和RNA豐度均顯著高于其他組，且趨勢一致。時間動態(tài)檢測顯示，ARE-F組48小時RNA豐度為Non-ARE組的4.8倍，蛋白表達峰值延遲至24小時。體內實驗中，ARE-F組在小鼠體內6、24、48小時的生物發(fā)光信號均強于Non-ARE組，延長了高蛋白表達窗口。
圖例2：ARE插入3'UTR的位置篩選
3.HuR蛋白與ARE結合的必要性驗證
為明確分子機制，研究團隊開展HuR沉默實驗和RNA下拉實驗。轉染siHuR后，細胞內HuR蛋白減少60%，ARE-F組熒光素酶表達和RNA豐度顯著下降，Non-ARE組無變化。RN下拉實驗中，僅生物素標記的ARE-F探針組檢測到35kDa的HuR蛋白條帶，對照組未檢測到，證實HuR與ARE-F存在特異性結合，且該結合是ARE發(fā)揮作用的關鍵。
圖例3：HuR蛋白與ARE結合的必要性驗證
4.ARE序列的理性設計與優(yōu)化
從天然基因庫篩選13種ARE序列，僅含重復 “AUUUA” 的ARE-5、ARE-9與ARE-F能顯著提升蛋白表達。對ARE-F(50nt)截短后，鑒定出9nt的最短功能序列AUUUAUUUA(ARE-V8)，其增強效果與全長一致。進一步優(yōu)化 “AUUUA” 重復長度發(fā)現(xiàn)，60nt的ARE-T60增強效果優(yōu)，蛋白表達和RNA豐度均高于ARE-F。該效果在不同細胞系、體內模型中均驗證成立，且不受核苷酸修飾和UTR類型限制。
圖例4：ARE序列的理性設計與優(yōu)化
5.優(yōu)化后ARE的廣譜應用價值驗證
構建EGFP、mCherry、OVA 的ARE-F/ARE-T60優(yōu)化載體，通過激光共聚焦、流式細胞術和Western blot實驗證實，優(yōu)化組蛋白表達量顯著高于原始序列組。小鼠免疫實驗中，OVA-ARE-T60誘導的IFN-γ分泌細胞數(shù)量約為原始OVA組的2倍，OVA特異性IgG抗體水平也顯著更高。共轉染Hu質粒與ARE-F mRNA可進一步提升熒光素酶表達，表明增強HuR表達能放大ARE的調控效果，證實優(yōu)化后的ARE可作為通用型翻譯增強工具。
圖例5：優(yōu)化后ARE的廣譜應用價值驗證
知識分享：研究亮點
1 提出在mRNA的3'UTR起始位置插入富腺苷酸/尿苷酸元件(ARE)的新策略，通過錨定胞質RN結合蛋白HuR，同步提升mRNA的胞內穩(wěn)定性與翻譯效率。
2 明確“AUUUA”是ARE的核心功能元件，鑒定出9nt的最短有效序列(AUUUAUUUA)，并優(yōu)化得到60nt的最優(yōu)序列(ARE-T60，其增強效果不受核苷酸修飾和UTR類型限制。
3 證實優(yōu)化后的ARE序列具有廣譜適用性，可顯著提升熒光蛋白、抗原(如 OVA)等多種蛋白的表達，且能增強mRNA疫苗誘導的細胞免疫和體液免疫應答。
參考文獻：
Molecular Therapy - Nucleic Acids ( IF 6.1 ) Pub Date : 2025-02-12 , DOI: 10.1016/j.omtn.2025.102485.
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